«ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

Биотехнология – это направление научно-технического прогресса, использующее биологические процессы и агенты для целенаправленного воздействия на природу, а также в интересах промышленного получения полезных для человека продуктов, в частности лекарственных средств.

Краткая историческая справка о возникновении и развитии биотехнологии.

Возникновение, становление и развитие биотехнологии условно можно подразделить на четыре исторических периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический.

Эмпирический (от греч.empeirikos – опытный) или доисторический период – самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет(6000 тыс. лет до нашей эры и около 2000 лет – нашей эры). Древние люди интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов. К тому же эмпирическому периоду относятся получение кисломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.

Второй, этиологический (от греч. aitia – причина) период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину 19 в. и первую треть 20 в. (1856 – 1933). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 – 1895) – основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин. Пастер вскрыл микробную природу брожения, доказал возможность жизни в бескислородных условиях,создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии. Работы Луи Пастера были продолжены его учениками и сотрудниками: Э. Дюкло, Ж. Вильеменом, И.И. Мечниковым.

Параллельно с Л. Пастером работал в Германии, а позднее – во Франции выдающийся миколог А. де Бари (1831 – 1888) – основоположник физиологической микологии. Он создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе современных классификационных схем микро- и макромицетов. Де Барии – основоположник микофитопатологии – науки о грибковых (грибных) болезнях растений( под его руководством сформировалась плеяда выдающихся ученых, в том числе из России: Ф.М. Бальфур, И.В. Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М.С. Воронин, А. Кох, А.С. Фаминицин и др.)

Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.) В этот период было начато изготовление пищевых прессованных дрожжей. А также некоторых продуктов обмена (метаболизма) ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот. Во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.

Третий период развития биотехнологии – биотехнический, начался в 1933 г., тогда была опубликована работа А. Клюйвера и Л.Х.Ц. Перкина «Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов. После этого началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечивающего проведение процессов в стерильных условиях.

Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (1939 – 1945гг.). (Работами многих учены была показана возможность механизации процессов брожения, культивирования различных клеточных продуктов для нужд человека и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: антибиотики (пенициллин, стрептомицин, тетрациклин), декстран, ряд аминокислот и др.)

Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том числе главного из них – биореакторов. Это оборудование используется и в настоящее время.

Четвертый период в биотехнологии - генотехнический (от греч. genesis - происхождение, возникновение, рождение) начался с 1972 года. В этом году П. Берг со своими сотрудниками (США) создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако без фундаментальных работ Ф.Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозможно достичь современных результатов в области биотехнологии.

Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнологических процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть генотехнического периода.
Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусственно встроенную генетическую информацию об этом гормоне. В настоящее время разрабатываются или уже выпускаются следующие генно-инженерные препараты: интерфероны, фактор некротизации опухоли (TNF), интерлейкин-2, соматотропный гормон человека и его аналог – соматомедин С и др. Проводится много работ на стыке генетической инженерии и гибридомной технологии – производство моноклональных антител, получение которых привело к революционным изменениям, в первую очередь, в области диагностики многих инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Основные направления и разделы биотехнологии

В последние годы происходит бурное развитие биотехнологии, определились сферы приоритетного внедрения конкретных результатов биотехнологических разработок и, как следствие, были выделены основные направления и разделы биотехнологии. К ним относятся:

медицинская биотехнология,
иммунобиотехнология,
биогеотехнология,
инженерная энзимология,
биоэнерготехнология,
космическая биотехнология и др.

К медицинской биотехнологии относят те производственные процессы, которые завершаются созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицинского назначения (диагностического, профилактического и лечебного действия). Это антибиотики, некоторые витамины, коферменты и ферменты, , которые могут применяться как самостоятельные лекарственные средства или вспомогательные вещества при создании различных лекарственных форм, аминокислоты, нуклеозиды и др.

Иммунобиотехнология объединяет производство вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, моноклональных антител и др. На основе иммунобиотехнологических процессов создаются также профилактические лечебные средства. Вместе с тем иммунотехнологические процессы по целевым продуктам вышли за пределы медицинского назначения.

Все достижения позволяют говорить сегодня о биотехнологии лекарственных средств. Если взять за основу для анализа современную номенклатуру лекарственных средств, включающую 33 фармакотерапевтических группы препаратов, то как минимум треть из них производится с использованием современных биотехнологий. В дальнейшем это направление исследований и разработок по биотехнологии будет иметь тенденцию к неуклонному росту.

Биотехнология открывает перед фармпромышленностью возможность производить антибиотики, ряд незаменимых аминокислот, некоторые витамины, ферменты, антиферменты, гормоны, ингибиторы гормонов, большую часть кровезаменителей, иммуногены, адаптогены, алкалоиды, биорадиопротекторы, средства пассивной иммунотерапии, иммуномодуляторы, иммунные диагностикумы, биосенсоры и др. В других случаях биотехнология используется как этап производства лекарственного средства.

При использовании биотехнологий в фармации их реализуют выращиванием культур тканей высших растений в виде каллуса, суспензионным культивированием клеток животных и растений, культивированием химерных клеток, в геном которых встроены опероны, ответственные за биосинтез лекарственной субстанции. Кроме того, биотехнологии могут успешно конкурировать с тонкими химическими технологиями на отдельных этапах изготовления лекарственного средства, а в ряде случаев Сущность биогеотехнологии сводится к использованию микроорганизмов для добычи полезных ископаемых, например, цветных металлов, нефти; для окисления метана в угольных шахтах и т.д.

Инженерная энзимология – это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответствующих целевых продуктов. Биообъект здесь – фермент (или комплекс ферментов).

Биоэнерготехнология включает биотехнологические процессы, связанные с получением источников энергии – углеводов и биогаза. Запасы энергии в растительном покрове Земли, создаваемом с помощью фотосинтеза, сопоставимы с запасами энергии природных ископаемых. Биогаз образующийся в результате метанового брожения биомассы (навоз, солома, помет, водоросли, целлюлозная масса), представляет собой смесь, главные компоненты которой метан (65%), углекислый газ (30%) и сероводород (1%).

Космическая биотехнология делает первые шаги в космосе, осваивая специфические неземные условия. Очевидно, что космос создает для биотехнологических процессов не только большие трудности, но и большие преимущества. Они обусловлены, главным образом, невесомостью, существенно изменяющей течение физико-химических процессов, на которых основаны многие биотехнологии.

Объекты биотехнологии

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы-микромицеты и макромицеты, протозойные микроорганизмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционально сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты и др.)

В современной фармпромышленности используется очень широкий ассортимент биообъектов, группировка которых весьма сложна и наиболее рационально может быть выполнена на основе принципа их соразмерности. При этом биообъекты объединяют в пять основных групп.

К первой группе относятся биообъекты размером от 10 м до 1см. К ним относятся: доноры (человек, корова, лошадь и другие животные); растения-бионакопители сапонинов, алкалоидов и т. п.; ядовитые животные и растения – донаторы ядов и др.

Вторая группа включает биообъкты размером от 1см до 1мм. К ним относятся гигантские водоросли, продуценты альгинатов (загустители, радиопротекторы); каллусные культуры меристемы (продуценты панаксозидов, биотрансформаторы дигитоксина и др.); культуры тканей – дерма (искусственная кожа); культуры клеток – лейкоцитов, продуцентов интерферонов.

В третью группу входят биообъекты размером от 1мм до 1 мкм. Сюда относятся клетки эукариот в культуре; клетки низших эукариот (плесени, дрожжей) и прокариот в культуре.

К четвертой группе относятся биообъекты размером от 1мкм до 1нм. К ним относятся бактериофаги и вирусы. В последнюю, пятую группу включают биообъекты размером менее 1мкм – информационные макромолекулы (ДНК), макромолекулы с ферментативной активностью (ферменты-биокатализаторы, индивидуальные и мультиферментные комплексы), макромолекулы-носители (антитела и др.)
Важное значение в биотехнологии имеют макрообъекты, к которым относятся различные животные и человек.

Свинья является донатором слизистой желудка для производства пепсина и поджелудочной железы – для производства инсулина. Коза в этой же роли выступает для получения гетерологической антисыворотки к вирусу клещевого энцефалита.

Для получения различных вакцин в качестве объектов для размножения вирусов используют органы и ткани, в том числе эмбриональные, различных животных: почки обезьян (вакцины против полиомиелита), почки морских свинок и фибробласты японских перепелок (противокоревая живая сухая вакцина), фибробласты куриного эмбриона (вакцина против клещевого энцефалита), мозговая ткань целостных организмов кроликов, крыс, овец (антирабические вакцины – для профилактики бешенства).

Необходимо отметить, что термином «донор» в данном случае обозначен биообъект, поставляющий материал для процесса производства лекарственного сырья без ущерба для собственной жизнедеятельности, а термином «донатор» - биообъект, у которого забор материала для производства лекарственного средства оказывается несовместимым с продолжением жизнедеятельности.

Принципы генетической инженерии
Современную биотехнологию нередко характеризуют как биологию на основе генетической инженерии.

Генетическая инженерия – это методы получения рекомбинантных ДНК, объединяющих последовательности разного происхождения. В настоящее время генетическую инженерию трактуют как искусство использования знаний, методов и техники физико-химической биологии и молекулярной генетики для конструирования организмов с заданной наследственностью. Под искусством, в данном случае, подразумевается умение организовать и методически реализовать генно-инженерную задачу – получить рекомбинантную ДНК (рДНК) с последующим включением ее в реципиентную клетку или осуществить перенос целых хромосом от клеток-доноров к клеткам-реципиентам.

Сущность генной инженерии состоит в целенаправленном использовании перестроек естественного генома, осуществляемых in vivo или in vitro, для изменения генетических характеристик известных, т.е. прямое манипулирование рекомбинантными ДНК, включающими отдельные гены животных объектов. Геном – это совокупность всех генов организма; ген – материальный носитель наследственности, единица наследственной информации, способная к воспроизведению и расположенная в определенном участке (локусе) данной хромосомы; ген обеспечивает преемственность в поколениях того или иного признака или свойства организма; в химическом отношении ген соответствует участку молекулы ДНК или РНК (у вирусов и фагов), включающему от нескольких десятков до 1000-1500 нуклеотидов и определяющему структуру одного белка или одной полипептидной цепочки; хромосомы – структурные элементы клеточного ядра, содержащие ДНК, в которой закодированы основные признаки организма, заключена наследственная информация организма; в хромосомах расположены гены. (Сущность геномной инженерии заключается в целенаправленной глубокой перестройке генома акариот, прокариот и эукариот, вплоть до создания новых видов, т.е. перенос всего или большей части генетического материала от одной клетки к другой. При геномной инженерии возможно получение половых (слияние гамет) или соматических (слияние не половых клеток) гибридов. Соматические гибриды способны формироваться лишь в искусственных условиях у прокариот и у эукариот, т.е. у клеточных форм (клеточная инженерия). В случае переноса изолированных хромосом от клетки-донора одного организма в клетку-реципиент другого организма говорят о хромосомной инженерии. Объектами ее являются хромосомы клеток прокариот и эукариот. Благодаря хромосомной инженерии стали возможными получение высокомолекулярных биологически активных веществ, присущих человеку, лечение наследственных заболеваний, селекция пород домашних животных и различных видов растений.)

Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. Рекомбинация – это любой процесс, способный привести к возникновению клеток или организмов с двумя или более наследственными детерминантами, по которым их родители различались между собой и которые соединены новым способом.

Живые организмы, чаще всего клетки прокариот и эукариот, обладают рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами), которые узнают чужеродную ДНК, проникшую в организм, и расщепляют ее, таким образом, сводя на нет генетическую рекомбинацию между эволюционно удаленными геномами. Обмен генами, которые представляют собой сегменты ДНК, равно как и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно осуществить посредством рДНК- биотехнологии in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности, на кишечной палочке, в клетки которой вводили гены животных и человека и добивались их репликации

(репликация – процесс самовоспроизведения нуклеиновых кислот, обеспечивающий точное воспроизведение генетической информации).
На фоне растущего народонаселения на планете и экологических бед место и роль рДНК- биотехнологии определяются потребностью людей в пищевых продуктах, и прежде всего в белках; в различных лекарственных средствах; в исправлении многочисленных наследственных заболеваний.

С помощью гибридомной технологии предложено получение моноклональных антител (МкАТ) –продуктов одного клона клеток.
Область применения МкАТ в настоящее время обширна. Они применяются для диагностики в проведении иммунологических анализов биологических жидкостей и клеток организма, микроорганизмов, вирусов и т.п., для типирования групп крови и тканей; в терапии – для воздействия на отдельные клеточные популяции с целью влияния на иммунные регуляторные механизмы антител к лимфокинам, для иммунорегуляции с помощью антиидиотипических антител, для направленного транспорта лекарственных веществ, элиминации токсинов, иммуноглобулинов и аллергенспецифичных антител. Моноклональные антитела используются в технологии для идентификации и очистки молекул и клеток, несущих специфический антиген, а также в научных исследованиях для изучения этиологии и патогенеза различных заболеваний, исследования системных и межсистемных механизмов регуляции и создания новых лекарственных биопрепаратов и др.

Процессы и аппараты в биотехнологии
Биотехнологические процессы можно подразделить на:
биологические,
биохимические
биоаналогичные.

Биологические основываются на использовании акариот, прокариот и эукариот, биохимические – на использовании ферментов, биоаналогичные – на химическом синтезе или полусинтезе веществ, функционально близких или эквивалентных первичным или вторичным метаболитам живых организмов (получение производных пенициллина и цефалоспорина, тетрациклина, нуклеиновых оснований и др.)

Многие процессы биотехнологии являются общими, например, стадии ферментации. Специальные биотехнологические процессы связаны в большей степени с особенностями биообъектов. Достаточно сравнить здесь культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах для приготовления вакцин и выращивание пеницилла – продуцента антибиотика бензилпенициллина в биореакторах емкостью 100м3. В сравнении с растительными и животными клетками микробы размножаются быстрее и, следовательно, у них быстрее протекают все метаболические обменные процессы.

Поскольку принципы культивирования микроорганизмов, растительных и животных клеток различны, то используют и различное оборудование.

Однако для культивирования любых биообъектов требуется обязательное условие соблюдения асептических условий производства.
Разнородные производства на основе биотехнологий носят многостадийный характер и включают наряду с биотехнологическими стадиями большое число других процессов, характерных для фармацевтической технологии, в частности разделение фаз, экстракция, стерилизация и др.
В процессе биотрансформации имеет место видоизменение какой-либо молекулы-предшественника конечного продукта или превращения одного продукта в другой.

Инженерно-технологическая база, используемая биотехнологией лекарственных средств в настоящее время позволяет создать для микробов техногенную экологическую нишу, где они могут существовать в монокультуре. Для этого используется специальный аппарат (устройство), который называют биореактором.

Бактерии и грибы в большинстве своем выращивают в однотипных биореакторах, имеющих почти одинаковую схему, в которую входят: ферментатор, многокорпусной вентиль стерильный (для подачи питательной среды, посевного материала, подпитки и пр.), системы регулирования рН, температуры, подачи пеногасителя, системы контроля расхода воздуха, пробоотборник, электродвигатель.
Растительные клетки, имеющие клеточные стенки, растут, размножаются и развиваются значительно дольше, чем большинство бактерий и грибов, что вносит определенные коррективы в аппаратурное оформление соответствующих биотехнологических процессов.
Культуры клеток животных и человека, не имеющих клеточных стенок при культивировании, являются более ранимыми и требовательными к условиям своего существования, чем клетки других прокариот и эукариот. Поэтому оборудование для них можно отнести к разряду «тихоходного», обеспечивающего нежное обращение с биообъектами.

Субстраты для культивирования биообъектов. Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов, а также эффективный синтез целевого продукта. Неотъемлемой частью питательной среды служит вода, поскольку все процессы жизнедеятельности протекают только в водной среде.

Питательные вещества образуют в среде истинные (минеральные соли, сахара, аминокислоты, карбоновые кислоты, спирты, альдегиды и др.), коллоидные растворы высокомолекулярных веществ (белки, липиды, неорганические вещества типа железа гидроксида).
Биотехнология в настоящее время все более ориентируется на разнообразные виды недорогого, доступного и возобновляемого сырья, наиболее важным видом которого является растительная масса. В биотехнологических процессах стремятся наладить безотходное производство, когда отходы одного процесса служат сырьем для последующего.

Выделение и очистка продуктов биологических процессов. Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многогранную систему: в водной фазе содержатся клетки-продуценты, продукты их жизнедеятельности, непотребленные компоненты питательной среды и др. При выделении учитывают место накопления целевого продукта: внутриклеточно или внеклеточно.
Первый вариант выделения целевого продукта самый простой. На этой схеме базируется производство биовита (добавка к корму скота), основанного на использовании продуцентов антибиотика хлортетрациклина – стрептомицетов. (Кальциевый комплекс хлортетрациклина осаждают из культуральной жидкости при рН выше 7,0. Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки продуцента. Так в осадке вместе с биомассой оказываются внеклеточный антибиотик и внутриклеточный витамин В12. Осадок фильтруют, сушат, измельчают, добавляют отруби в качестве носителя и фасуют. )

Второй вариант применяется, если целевым продуктом является биомасса клеток, например кормовые или пекарские дрожжи. В этом случае вначале необходимо провести их концентрирование. При этом широко используют флотацию, с помощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4-6 раз. Кроме того, для концентрирования можно использовать центрифугирование.

В третьем варианте приведены методы извлечения целевых продуктов из клеток биомассы. Полиеновые антибиотики, например, экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток.
Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости проходит по схеме четвертого варианта. Его начинают при содержании продуктов около 1,5%. Однако, чтобы можно было эффективно выделять вещества из культуральной жидкости с помощью осаждения, кристаллизации, высушивания и др., культуральные жидкости необходимо подготовить к этим процессам. (Для этого проводят коагуляцию коллоидных примесей, чтобы получить хорошо отфильтровываемые осадки. При этом применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой и др. Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами – флоккулянтами. Затем образовавшийся осадок отфильтровывают, а из нативного раствора выделяют целевой продукт, используя экстракцию, ионный обмен, осаждение, кристаллизацию и другие методы выделения и очистки индивидуальных веществ.)

Лекарственные средства, полученные методами различных биотехнологий, затем используются для производства необходимых лекарственных форм.

Перейти на сайт